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Le règne de Charles Quint correspond à la naissance en Allemagne du luthéranisme.
Défenseur de la foi, sacré par le pape en 1530, le petit-fils et successeurs des "Rois Catholiques" ne peut se soustraire à l'obligation de défense de la foi catholique et une accalmie dans le conflit l'opposant à François Ier lui permet de s'attacher à cette mission.
L'année même de son sacre, Charles Quint convoque la Diète d'Augsbourg. Cette diète est convoquée par l’empereur pour poser la question de la soumission des princes du Saint-Empire convertis à la Réforme luthérienne. La réunion tourne à son désavantage, les princes du Nord réformistes se coalisant sous l'autorité du landgrave Philippe Ier de Hesse et de l'électeur Jean-Frédéric Ier de Saxe.
Le 25 juin 1530, les protestants présentent au souverain la Confession d'Augsbourg, texte fondateur du "Luthéranisme" rédigée par Philippe Melanchthon (qui représente Luther, qui, excommunié en 1521 et mis au ban de l’Empire ne pouvait participer à la diète) et Camerarius, qui sera rejetée par les théologiens catholiques. Malgré quelques modifications conciliatrices apportées par le prudent disciple du bouillant réformateur au texte original, Charles Quint la fait proscrire par la diète dont les membres sont a fortiori catholiques.
Le 20 septembre 1530, Luther conseille aux princes protestants de se préparer à la guerre plutôt que d'accepter de transiger avec l'Église catholique, ce qui aboutit début 1531 à la formation de la Ligue de Smalkalde menée par Philippe de Hesse. La diète se termine le 19 novembre 1531 avec le recès d’Augsbourg qui confirme l'édit de Worms : il ordonne aux princes coalisés de se soumettre avant le 15 avril 1531, de rétablir dans leurs États la juridiction épiscopale et de restituer les biens de l'Église.
Conscient de la nécessité de réformer l'Église et résoudre le problème protestant, le pape Paul III convoque le concile de Trente, dont les travaux démarrent le 5 décembre 1545. Les protestants ne reconnaissent pas le concile et l'empereur déclenche les hostilités en juin 1546, avec une armée équipée par le pape et commandée par Octave Farnèse, futur duc de Parme, une armée autrichienne sous les ordres de son frère Ferdinand de Habsbourg et une armée de soldats des Pays-Bas sous les ordres du comte de Buren.
Grâce à l'appui du prince-électeur Maurice de Saxe, Charles Quint remporte sur Jean Frédéric de Saxe la bataille de Mühlberg en 1547, emprisonne Philippe de Hesse et obtient la soumission des princes rebelles. En 1551, le même Maurice de Saxe réalise un renversement d'alliance pour délivrer le landgrave de Hesse-Cassel retenu prisonnier par Charles-Quint. Ce dernier, trahi par le duc Maurice, est contraint à traiter et à accorder, par la paix de Passau (1552), une amnistie générale et le libre exercice du culte réformé. A contre cœur, il laisse à son frère Ferdinand le dernier mot : le 3 octobre 1555, est signée la paix d'Augsbourg. L'unité religieuse de l'Empire est sacrifiée au profit d'un ordre princier : chaque feudataire de l'Empire peut choisir laquelle des deux religions sera seule autorisée dans ss domaines. C'est le principe cujus regio, ejus religio (la religion du prince est la religion du pays).
Dans ses états patrimoniaux, les Pays-Bas Belgicus, où il est rentré pour y passer les denières années de son règne, ayant ainsi une prise directe sur le pays de sa jeunesse, Charles n'a pas à tenir compte de ces puissantes oppositions et peut agir comme il l'entend. Dans les Flandres, ses "placards", édits très stricts contre l'hérésie, seront appliqués jusqu'à la fin de son règne et repris par son successeur, son fils Philippe II. C'est l'introduction d'une inquisition "moderne" sur le modèle de celle que Charles a découverte en Espagne. Les condamnations à mort sont plus nombreuses dans ce petit territoire sous son règne que dans tout le royaume de France à la même époque.
L'empire de Charles Quint a le désavantage d'être dispersé et donc vulnérable aux révoltes intérieures mais aussi aux attaques ennemies des Français sur son flanc ouest, de leurs alliés turcs sur son flanc est et en mer Méditerranée des corsaires comme Arudj Barberousse.
L'un des principaux points de contrôle disputés est Tunis et plus généralement les villes d'Afrique du Nord. Tunis est un point stratégique de contrôle de la Méditerranée par rapport à la Sicile et au royaume de Naples et un point de passage vers le Levant.
En 1534, Kheir el-Din Barberousse, le frère d'Arudj, renverse le bey Moulay Mohamed de Tunis.
Mulay Hassan demande à l'empereur d'équiper une flotte et d'entreprendre une expédition punitive contre Tunis, non seulement pour le rétablir sur le trône, mais aussi pour freiner la piraterie sur les côtes de Sicile et d’Italie.
Charles Quint arme une flotte de 62 galères et de 150 autres navires qui partent de Barcelone le 29 mars 1535. Les troupes impériales et les troupes espagnoles, commandées par le Génois Andrea Doria, avec l'appui de l'ordre de Saint-Jean de Jérusalem, arrivent à proximité de Carthage et de Tunis. Tunis est prise 21 juillet 1535. Moulay Hassan est restauré, 20 000 chrétiens esclaves sont libérés. Moulay Hassan devient un vassal de l'Espagne entérine l'abolition de l'esclavage et la tolérance religieuse.
En revanche, l'expédition sur Alger en 1541 se solda par un désastre et redonna aux barbaresques le sud de la Méditerranée.
Souffrant d'une goutte particulièrement invalidante5, il envisage assez tôt de se défaire du pouvoir. Le processus commence pour ainsi dire en 1540. Cette année, il investit en secret son fils, le prince Philippe, du duché de Milan, vacant depuis 1535. Cette investiture est rendue publique en 1546. Deux ans plus tard, Charles fait venir celui-ci à ses côtés pour le faire reconnaître comme héritier du Brabant et des Flandres et le présenter aux princes de l'Empire dans l'espoir que Philippe puisse un jour briguer la couronne impériale. En 1553, enfin, Philippe épouse Marie Tudor; pour éviter une union inégale entre le duc de Milan et la reine d'Angleterre, son père lui offre le royaume de Naples. Dans ces mêmes années 1550, la question de la succession devient un sujet de contentieux entre Charles et son frère Ferdinand. Le roi des Romains s'irrite de voir son aîné privilégier partout Philippe alors qu'il avait promis à ses neveux autrichiens des parcelles de l'héritage en Flandre et en Italie.
L'année 1555 voit une accélération de ce processus. La mère de Charles, Jeanne de Castille, meurt le 11 avril 1555. L'Empereur en est très affecté, bien qu'il n'ait jamais hésité à la maintenir en détention à Tordesillas et qu'ils ne se soient jamais connus. La signature de la Paix d'Augsbourg, le 25 septembre lui laisse le sentiment d'un échec cuisant. En même temps, les victoires de ses armées à Sienne et Gimnée ainsi que la présence de Philippe dans les Flandres lui donnent l'impression que son empire est suffisamment stable pour procéder à cette renonciation.
Le 22 octobre 1555, affaibli par la vieillesse et les maladies, désabusé par les revers, Charles Quint convoque les chevaliers de l'Ordre de la Toison d'or pour leur faire part de sa résolution. Il se dépouille de sa qualité de chef et souverain de l'ordre et fait promettre aux chevaliers de servir son fils comme ils l'ont servi. Trois jours plus tard, à Bruxelles, devant les états généraux, il abdique solennellement, dans la grande salle du palais du Coudenberg. C'est là où quarante ans plus tôt il avait été proclamé duc de Bourgogne, duc de Brabant, comte de Flandres et des autres territoires composant le Leo Belgicus devant ces mêmes états généraux des Pays-Bas. Dans une ambiance de larmes, il fait le décompte des voyages incessants qu'il a consentis pour le bien de ses pays et de la Chrétienté avant de faire reconnaître Philippe comme le nouveau duc de Bourgogne, souverain des Pays-Bas.
Quelques mois plus tard, le 16 janvier 1556, alors qu'il se dirige vers l'Espagne pour s'y retirer du monde, il lui transmet également son héritage espagnol. Les dernières transactions ont lieu en 1558 : Charles se dépouille de la Franche-Comté et ordonne aux électeurs du Saint-Empire de considérer désormais Ferdinand comme lui-même. La diète en prend acte en élisant, le 24 février 15581, Ferdinand comme Empereur élu des Romains.
Il se retire dans un monastère de Yuste, où une petite maison a été aménagée pour lui ; il y meurt le 21 octobre 1558, à l'âge de 58 ans, de la malaria (maladie endémique dans la région jusqu'en 1960). Ses cendres seront transférées en 1574 à la nécropole royale de l'Escorial, édifiée par son fils Philippe à 40 km de Madrid.